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Chapter 01
蛋白磷酸化检测通用小技巧
检测样本和蛋白对磷酸化检测有哪些影响？
● 磷酸化蛋白通常在样本中含量都很低，在制备样本时需要参考已有研究文献对样本进行预刺激和诱导处理，使目标蛋白磷酸化高水平表达。
● 信号弱或无信号可能意味着诱导不充分，建议使用说明书中提到的样本或已有报道高表达的样本作为阳性对照。
裂解液成份需要注意什么？
● 样本制备中裂解细胞或组织时，裂解缓冲液需新鲜制备，并加入新鲜制备的复合蛋白酶抑制剂和复合磷酸酶抑制剂，以防止蛋白降解及磷酸化蛋白发生去磷酸化。
● 样本一旦开始裂解，蛋白水解、去磷酸化和变性也随即开始。在样本制备的过程中务必始终将样品置于冰上或维持在4 ?C低温环境中，以减缓这些反应。
所有的封闭液都适合磷酸化检测吗？
● 在膜封闭的过程中，建议使用5%BSA作为封闭剂。
● 脱脂奶粉含有酪蛋白，对于酪蛋白激酶，酪蛋白本身就是一种磷酸化蛋白底物，有可能会结合磷酸化特异性抗体而易产生高背景，建议此类靶标蛋白的检测使用5%BSA作为封闭剂。
怎样确认阳性信号确实是磷酸化信号呢？
● 在实验中，建议添加一组阴性对照；在封闭后，用磷酸酶处理膜，使蛋白发生去磷酸化，作为阴性对照，以验证抗体是特异性地结合磷酸化靶标蛋白，排除非特异性结合。
我关注的是靶标蛋白磷酸化情况，还需要检测靶标蛋白总量吗？
● 在检测磷酸化蛋白的同时，建议同时检测样本中对应靶标的总蛋白量。一方面，检测总蛋白可以验证目标蛋白在样本中是否存在；另一方面，通过对蛋白总量的检测，计算磷酸化蛋白/总蛋白比例可作为蛋白质磷酸化程度的指标，来判断样本中靶标蛋白磷酸化程度，可为后续结果分析提供依据。如未检测到磷酸化信号以及靶标蛋白总量，可能是样本中没有靶标蛋白；或者根据靶标蛋白总量以及磷酸化蛋白含量，分析刺激或诱导对靶标蛋白磷酸化水平的影响。
Chapter 02
热门靶标磷酸化修饰检测实验关键点
为什么总是很难检测到eNOS或磷酸化修饰的eNOS啊？
主要原因有两点：
eNOS蛋白在裂解液中储存时极易发生降解，为了避免蛋白降解后导致检测信号减弱，请使用新鲜制备的全细胞裂解液，并立即用于WB检测。裂解液中使用磷酸酶抑制剂，防止蛋白在提取的过程中被去磷酸化。
部分细胞系在经过药物刺激处理之后更易检测到eNOS蛋白（eg：10 ?g/ml LPS刺激处理HepG2细胞2小时）和eNOS（phospho S1177）蛋白（eg：pervanadate或VEGF刺激处理的HUVEC细胞；PMA刺激处理的THP1细胞）（图1，2）。
此外，eNOS蛋白预测大小为133 kDa左右，是一个较大的蛋白，建议按照大蛋白电泳和转膜方法操作实验，具体建议如下：
● 电泳：
? 对于分子量较大的靶标蛋白，建议使用8%浓度的分离胶进行电泳。
● 转膜：
? 建议在转膜缓冲液中加入SDS至终浓度为0.1%。
? 建议使用0.45μm的PVDF膜。
? 建议转膜缓冲液中使用10%甲醇或更低浓度。
?建议转膜完成后使用丽春红染色，确定转膜是否成功。
图1：WB-Anti-eNOS (phospho S1177) 抗体 [EPR20991] ()。
泳道1：10 ?g HUVEC全细胞裂解
泳道2：10 ?g 经过100 uM pervanadate 刺激处理HUVEC 10min的全细胞裂解
一抗：eNOS (phospho S1177) 抗体 [EPR20991] ()，浓度 1/1000 稀释
二抗：HRP标记的山羊抗兔IgG (H L) ()，浓度 1/100000 稀释。
预测条带大小：133 kDa
检测条带大小：140 kDa，60 kDa条带可能是eNOS的剪切形式
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WB检测eNOS (phospho S1177)时出现好多条带，是杂带吗？怎样确认哪条是磷酸化条带呢？需要检测eNOS蛋白总量吗？
eNOS蛋白在裂解液中储存时极易发生降解，并且eNOS蛋白存在除预测大小为133 kDa形式外，还存在约60 kDa的剪切体形式，因此无论是在检测eNOS蛋白还是磷酸化修饰形式的eNOS蛋白时，都有可能出现多带现象。
因此可通过设置phosphatase去磷酸化的处理组，以判断磷酸化信号的特异性（图3）。
在检测磷酸化eNOS蛋白的同时，还应同时检测样本中对应靶标eNOS的总蛋白量。通过对蛋白总量的检测，来判断样本中是否有eNOS，可为后续结果分析提供依据，例如如果未检测到磷酸化信号以及eNOS蛋白总量，可能是样本中没有eNOS；或者根据eNOS总量以及磷酸化蛋白含量，分析刺激或诱导对eNOS蛋白磷酸化水平的影响。
图3：WB-Anti-eNOS (phospho S1177) 抗体 [EPR20991] ()。
泳道1：10 ?g bEND.3全细胞裂解
泳道2：10 ?g 经过碱性磷酸酶处理bEND.3 一小时的全细胞裂解
一抗：eNOS (phospho S1177) 抗体 [EPR20991] ()，浓度 1/1000 稀释
二抗：HRP标记的山羊抗兔IgG (H L) ()，浓度 1/20000 稀释。
预测条带大小：133 kDa
检测条带大小：140 kDa
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在进行WB检测时，为什么很难检测到Y1007 Y1008磷酸化的JAK2？
主要原因包括两点，一是样本的原因，二是JAK2分子量在130 kDa左右，在电泳和转膜时也需特别注意，更详细的原因和解决方案如下：
（1）未处理的样本（eg：细胞/脑组织）较难检测到Y1007 Y1008磷酸化的JAK2蛋白，建议使用Pervanadate 进行预刺激处理（图4）。此外，裂解液中使用磷酸酶抑制剂，防止蛋白在提取的过程中被去磷酸化。
（2）大蛋白进行电泳和转膜建议如下：
●电泳：
? 对于分子量较大的靶标蛋白，建议使用8%浓度的分离胶进行电泳。
●转膜：
? 建议在转膜缓冲液中加入SDS至终浓度为0.1%。
? 建议使用0.45μm的PVDF膜。
? 建议转膜缓冲液中使用10%甲醇或更低浓度。
? 建议转膜完成后使用丽春红染色，确定转膜是否成功。
图4：WB- JAK2 (phospho Y1007 Y1008) 抗体 [E132] ()。
泳道1：15 ?g 小鼠海马裂解物
泳道2：15 ?g 小鼠P240海马裂解物
泳道3：15 ?g 小鼠P7海马裂解物
泳道4：15 ?g 大鼠海马裂解物
泳道5：15 ?g 大鼠P7海马裂解物
泳道6：15 ?g 大鼠大脑皮层裂解物
泳道7：15 ?g 人类大脑裂解物
泳道8：15 ?g 小鼠大脑裂解物
泳道9：15 ?g 大鼠大脑裂解物
泳道10：15 ?g C6（大鼠胶质肿瘤胶质细胞）全细胞裂解液
泳道11：15 ?g 使用50mM Pervanadate 处理 5 分钟的C6全细胞裂解液
一抗：JAK2 (phospho Y1007 Y1008) 抗体 [E132] ()。
二抗：HRP标记的山羊抗兔二抗（），浓度 1/20000 稀释。
预测条带大小：130 kDa
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在WB检测中，为什么很难检测到p-MLKL？
通常情况，样本需要坏死性凋亡的诱导刺激，如TSZ（TNF α Smac mimetic z-VAD）处理之后，才能检测到p-MLKL（图5）。
此外，我们还建议：
（1）进行磷酸化修饰检测时，请先确认细胞内MLKL总蛋白的含量。
（2）使用新鲜制备的样本，防止冻存样本导致磷酸化修饰减弱，并添加合适的磷酸酶抑制剂。
（3）推荐根据蛋白修饰不同，使用合适的阳性对照。
（4）如果使用常规裂解方法，检测到蛋白信号较弱时，我们建议尝试使用 1% SDS 热裂解方法来制备细胞裂解物。
图5：WB-重组Anti-MLKL (phospho S345)抗体[EPR9515(2)] ()
泳道1：未处理的 L-929（小鼠结缔组织成纤维细胞）全细胞裂解液。
泳道2：L-929用 20 ng/ml TNF α ( )、100 nM Smac mimetic和 20 ?M z-VAD ( ) 处理 8 小时，然后获得的全细胞裂解液。
检测条带大小：54 kDa
怎样判断样本诱导成功，可以检测p-MLKL？
磷酸化修饰的MLKL（p-MLKL）是坏死性凋亡的触发因素。它不存在于正常组织中，只能在感染、细胞受损或老化组织中检测到。MLKL在被RIPK3磷酸化后激活，定位于质膜并执行以钙流入和质膜损伤为特征的坏死性凋亡。
建议同时检测MLKL信号通路中上下游指标，确认诱导是否成功，例如同时检测激活状态的p-RIPK3。
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WB检测磷酸化修饰的p53时，为什么有时检测到有时检测不到呢？
p53在不同细胞系中的表达存在明显差异，翻译后修饰的p53蛋白，同样存在部分低表达细胞系需要诱导的情况，例如Etoposide处理的HepG2全细胞裂解液用来检测磷酸化修饰的p53蛋白（图6）。由于具体的刺激诱导条件与修饰形式和位点有关，请参考产品说明书选择合适的阳性对照。
建议在检测磷酸化修饰p53蛋白时，也同步检测p53蛋白的含量，确保细胞内含有足够量的靶标蛋白。裂解液中使用复合磷酸酶抑制剂以防止靶标蛋白被去磷酸化。
图6：WB- Anti-p53 (phospho S46) antibody [EP42Y] ()。
一抗：使用Anti-p53 (phospho S46) antibody [EP42Y] ()一抗，稀释比1/5000。
泳道1：未处理的HepG2全细胞裂解液；
泳道2：Etoposide处理的HepG2全细胞裂解液；
泳道3：Etoposide处理的HepG2全细胞裂解液，随后用碱性磷酸酶处理膜。
二抗：使用Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) () 二抗，浓度1/20000。
预测条带大小：53 kDa
检测条带大小：53 kDa
WB检测p53时，为什么有时检测到有时检测不到呢？
p53在不同细胞系中的表达存在明显差异。在高表达细胞系中，较容易可以检测到p53蛋白，例如A431全细胞裂解液；在部分低表达细胞系中，刺激诱导可以增强p53蛋白的检测信号，例如使用Doxorubicin诱导处理的HCT116全细胞裂解液，请根据样本类型和抗体说明书选择最合适的诱导条件（图7，8）。
图7：WB- Anti-p53 antibody [EPR17343] ()。
一抗：使用Anti-p53 [EPR17343]一抗，稀释比1/2000。
泳道1：20 ?g HEK-293全细胞裂解液；
泳道2：20 ?g A431全细胞裂解液。
泳道3：20 ?g Saos-2全细胞裂解液。
泳道4：20 ?g HL-60全细胞裂解液。
泳道5：20 ?g PC-3全细胞裂解液。
预测条带大小：44 kDa
检测条带大小：53，44 kDa
图8：WB-Anti-p53 [EPR17343]抗体产品 ()。
一抗：使用Anti-p53 [EPR17343]一抗，稀释比1/2000。
泳道1：未处理的HCT 116全细胞裂解液；泳道2：0.5?M Doxorubicin处理24小时的HCT 116全细胞裂解液。
二抗：使用Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) (ab97051) (Goat Anti-Rabbit IgG, (H L), Peroxidase conjugated)二抗，浓度1/20000。
预测条带大小：44 kDa
检测条带大小：53 kDa
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